|
|
Transcriptomic Characterization Using RNA-Seq Data Analysis
Abo Khayal, Layal ; Babula, Petr (oponent) ; Lexa,, Matej (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
The high-throughputs sequence technologies produce a massive amount of data, that can reveal new genes, identify splice variants, and quantify gene expression genome-wide. However, the volume and the complexity of data from RNA-seq experiments necessitate a scalable, and mathematical analysis based on a robust statistical model. Therefore, it is challenging to design integrated workflow, that incorporates the various analysis procedures. Particularly, the comparative transcriptome analysis is complicated due to several sources of measurement variability and poses numerous statistical challenges. In this research, we performed an integrated transcriptional profiling pipeline, which generates novel reproducible codes to obtain biologically interpretable results. Starting with the annotation of RNA-seq data and quality assessment, we provided a set of codes to serve the quality assessment visualization needed for establishing the RNA-Seq data analysis experiment. Additionally, we performed comprehensive differential gene expression analysis, presenting descriptive methods to interpret the RNA-Seq data. For implementing alternative splicing and differential exons usage analysis, we improved the performance of the Bioconductor package DEXSeq by defining the open reading frame of the exonic regions, which are differentially used between biological conditions due to the alternative splicing of the transcripts. Furthermore, we present a new methodology to analyze the differentially expressed long non-coding RNA, by finding the functional correlation of the long non-coding RNA with neighboring differential expressed protein coding genes. Thus, we obtain a clearer view of the regulation mechanism, and give a hypothesis about the role of long non-coding RNA in gene expression regulation.
|
|
|
The role of alternative splicing in plants
Földi, Marek ; Klodová, Božena (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
Alternativní sestřih představuje mechanismus regulace genové exprese, který udržuje, reguluje a vytváří genomovou diverzitu a pletivovou specificitu u rostlin. Zahrnuje odlišné spojování exonů v prekurzorových mRNA, což vede k více mRNA isoformám z jednoho genu. Vznik těchto isoformních variant a jejich následný překlad vede k subfunkcionalizaci proteinů a vytváří diverzitu ve struktuře a funkci. Alternativní sestřih je proto často důležitý v různých biologických procesech u rostlin, jako je vývoj, stresová odpověď, imunita a reprodukce. Klíčovými typy událostí alternativního sestřihu jsou retence intronů, vynechání exonů, alternativní 5'/3' sestřihová místa a vzájemně se vylučující exony. Regulace alternativního sestřihu zahrnuje cis-regulační elementy a trans-působící proteinové faktory, jako jsou serin/arginin bohaté (SR) proteiny a heterogenní jaderné ribonukleoproteiny (hnRNP). Tato práce shrnuje mechanismy a důsledky alternativního sestřihu ve vývoji rostlin, včetně zrání samčích a samičích gametofytů, meiózy a diferenciace buněk. Popisuje také metodologické přístupy, které umožňují studium alternativního sestřihu v celém genomu, včetně microarrays, RNA-seq a PCR. Lepší porozumění alternativnímu sestřihu poskytne pohledy do biologie rostlin a může usnadnit zemědělské a biotechnologické aplikace.
|
|
|
Regulace alternativniho sestřihu
Dušková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Trejbalová, Kateřina (oponent)
Alternativní sestřih pre-mRNA je důležitým buněčným mechanismem, který umožňuje produkci velkého množství proteinových isoforem z omezeného množství genů. Na regulaci sestřihu alternativních exonů se podílí cis-elementy na pre-mRNA a trans-vazebné faktory (SR a hnRNP proteiny). Vzhledem k tomu, že sestřih probíhá během transkripce, začíná se uvažovat o možné roli struktury chromatinu v regulaci alternativního sestřihu. V této diplomové práci jsme studovali vliv histonové acetylace na alternativní sestřih. Na bázi alternativního exonu EDB, který se nachází ve fibronektinovém genu, jsme vytvořili sestřihový reportér. Ukázali jsme, že inhibice histonových deacetyláz ovlivňuje alternativní sestřih EDB exonu z reportéru stejně jako sestřih endogenního exonu. Dále jsme ukázali, že struktura promotoru má vliv na sestřih alternativního EDB exonu z sestřihového reportéru. Zároveň jsme zjistili, že struktura promotoru ovlivňuje míru acetylace histonu H4 na reportérech. Vkládání EDB exonu do mRNA bylo nepřímo úměrné histonové acetylaci reportéru. Tyto výsledky by mohly vysvětlit proč odlišné promotory mají různé sestřihové poměry alternativních exonů.
|
|
|
Analýza genových produktů vznikajících v důsledku alternativního sestřihu pre-mRNA a jejich význam v onkogenezi karcinomu prsu.
Hojný, Jan ; Kleiblová, Petra (vedoucí práce) ; Malík, Radek (oponent) ; Boušková, Veronika (oponent)
Karcinom prsu je celosvětově nejčastěji diagnostikované nádorové onemocnění u žen. V 5-10 % všech případů je pozorována genetická souvislost, obvykle způsobená patogenní mutací v některém z predispozičních genů. Ačkoliv byla řada poškozujících mutací v kódující sekvenci těchto genů popsána, u velkého procenta familiárních případů (> 50 %) nebyla příčina dosud nalezena. Řada identifikovaných patogenních mutací byla lokalizována v konsenzních sestřihových místech, které mají za následek vznik aberantních sestřihových forem mRNA a z nich se odvíjející poškozené proteiny. Málo je však známo o variantách poškozujících regulační sestřihová místa, která mohou vést k tvorbě obdobných forem mRNA. Pro nepřímou analýzu variant, ovlivňujících přirozený sestřih, jsme navrhli metodiku detekce sestřihových variant jakéhokoliv genu založenou na multiplexní PCR a následné analýze pomocí NGS s vysokou citlivostí. Ověření této metodiky na modelu BRCA1 odhalila přítomnost 94 sestřihových variant v leukocytech periferní krve, zdravé prsní a přilehlé tukové tkáni, čímž byl vytvořen dosud nejpodrobnější katalog fyziologicky se vyskytujících mRNA variant BRCA1. Nejčastěji se vyskytující varianty, zachovávající čtecí rámec, byly přesně kvantifikovány pomocí RT-qPCR, která odhalila přítomnost 6 ubikvitně se vyskytujících...
|
|
|
Transcriptomic Characterization Using RNA-Seq Data Analysis
Abo Khayal, Layal ; Babula, Petr (oponent) ; Lexa,, Matej (oponent) ; Provazník, Ivo (vedoucí práce)
The high-throughputs sequence technologies produce a massive amount of data, that can reveal new genes, identify splice variants, and quantify gene expression genome-wide. However, the volume and the complexity of data from RNA-seq experiments necessitate a scalable, and mathematical analysis based on a robust statistical model. Therefore, it is challenging to design integrated workflow, that incorporates the various analysis procedures. Particularly, the comparative transcriptome analysis is complicated due to several sources of measurement variability and poses numerous statistical challenges. In this research, we performed an integrated transcriptional profiling pipeline, which generates novel reproducible codes to obtain biologically interpretable results. Starting with the annotation of RNA-seq data and quality assessment, we provided a set of codes to serve the quality assessment visualization needed for establishing the RNA-Seq data analysis experiment. Additionally, we performed comprehensive differential gene expression analysis, presenting descriptive methods to interpret the RNA-Seq data. For implementing alternative splicing and differential exons usage analysis, we improved the performance of the Bioconductor package DEXSeq by defining the open reading frame of the exonic regions, which are differentially used between biological conditions due to the alternative splicing of the transcripts. Furthermore, we present a new methodology to analyze the differentially expressed long non-coding RNA, by finding the functional correlation of the long non-coding RNA with neighboring differential expressed protein coding genes. Thus, we obtain a clearer view of the regulation mechanism, and give a hypothesis about the role of long non-coding RNA in gene expression regulation.
|
|
|
Role of promoter in the regulation of alternative splicing
Kozáková, Eva ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Bylo ukázáno, že až 95 % genů obsahujích více než dva exony, podstupuje alternativní sestřih. Regulace alternativního sestřihu je velmi složitý proces. Většina intronů je odstraněna z pre- mRNA během transkripce a přibývá důkazů, které poukazují na důležitost chromatinových modifikací v regulaci alternativního sestřihu. V této práci ukazujeme, že inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která způsobuje zvýšení acetylace histonů a zrychlení elongace Pol II, ovlivňuje alternativní sestřih přibližně 700 genů. Identifikovali jsme HDAC1, jejíž enzymatická aktivita je zodpovědná za změny v alternativním sestřihu. Poté jsme se zaměřili na Brd2 protein, který váže acetylované histony a ovlivňuje alternativní setřih ~ 300 genů. Dále jsme ukázali, že se Brd2 protein váže na promotory genů, které ovlivňuje. Dále jsme zjistili, že deplece histonacetyltransferázy p300 podporuje zahrnutí alternativního EDB exonu fibronektinového genu (FN1) v mRNA. Asociace p300 proteinu s CRE místy v promotoru je zprostředkována interakcí s CREB transkripčním faktorem. Vytvořili jsme sestřihové reportéry pod kontrolou arteficiálních promotorů obsahující CRE místa. Delece i mutace CRE míst v promotoru ovlivnila alternativní sestřih EDB exonu stejně jako deplece p300 proteinu. Poté jsme ukázali, že deplece p300 snižuje acetylaci...
|
|
|
Regulation of alternative splicing via chromatin modifications
Hozeifi, Samira ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Lanctôt, Christian (oponent)
Alternativní sestřih je jedním z mechanismů, který slouží k rozšiřování transkriptomu a proteomu v průběhu buněčného růstu, buněčné smrti, pluripotence, buněčné diferenciace a vývoje. Jak naznačují mnohé publikace, výběr sestřihového místa se odehrává v době, kdy je nascentní RNA v těsné blízkosti chromatinu. V této práci jsem se zaměřila na studium regulace alternativního sestřihu pomocí chromatinových modifikací, a to specificky na acetylaci histonů. V první práci popisujeme efekt inhibice histonových deacetyláz (HDACs), která ovlivňuje výběr sestřihového místa u ~700 genů. Ukázali jsme, že inhibice HDACs zvyšuje acetylaci na histonu H4 a posiluje procesivitu RNA polymerázy II (RNA pol II) v okolí alternativně sestřihovaného úseku. Dalším efektem inhibice HDACs je snížení asociace sestřihového faktoru SRp40, který reguluje sestřih fibronektinového alternativního exonu. Dále jsme ukázali, že Brd2 protein, který specificky váže acetylované histony, ovlivňuje transkripci 1450 genů. Po depleci Brd2 proteinu pozorujeme změnu v alternativním sestřihu u 290 genů. Na těchto a kontrolních genech jsme prozkoumali distribuci Brd2 proteinu a zjistili jsme, že Brd2 protein je lokalizován na promotorech ovlivněných genů. Dále jsme ukázali, že interakce Brd2 s chromatinem není závislá pouze na acetylovaných...
|
|
|
Charakterizace PTEN domény vybraných forminů II. třídy Arabidopsis
Přerostová, Sylva ; Cvrčková, Fatima (vedoucí práce) ; Havelková, Lenka (oponent)
Forminy jsou proteiny usnadňující tvorbu aktinových vláken. Ovlivňují strukturu cytoskeletu a účastní se cytokineze i směrovaného růstu. U Arabidopsis thaliana existují 2 třídy forminů, které obsahují FH1 a FH2 (Formin homology 1 a 2) doménu. Forminy třídy I mají většinou na N konci transmembránovou doménu, díky které mohou interagovat s membránami. Některé forminy třídy II obsahují PTEN doménu (Phosphatase and tensin homolog) odvozenou ze sekvence PTEN proteinů, která zřejmě ztratila funkci fosfatázy. Předpokládá se, že je schopná vazby na membránu, a to přes fosfatázovou část nebo přes C2 doménu. Tato práce byla zaměřena na formin AtFH13 z třídy II u Arabidopsis thaliana a na jeho PTEN doménu. Byly zjišťovány rozdíly mezi mutanty a kontrolou v délce kořenů u semenáčků a ve velikosti semen a semenných obalů. Na délce kořenů byl sledován také vliv dexametazonu na AtFH13. PTEN doména forminu byla pomnožena z cDNA, zaklonována do vektoru a sfúzována s YFP. Značený protein byl metodou tranzientní exprese vizualizován v pokožkových buňkách listů Nicotiana benthamiana. Mezi rostlinami mutantními v genu AtFH13 a kontrolou nebyl ve vybraných parametrech pozorován výrazný rozdíl. Dexametazon neměl na délku kořenů mutantních rostlin vliv. Semikvantitativní RT-PCR bylo prokázáno, že dexametazon nemá větší vliv ani na...
|
|
|
Regulace pre-mRNA sestřihu v prostředí buněčného jádra
Hnilicová, Jarmila ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Půta, František (oponent) ; Dvořák, Michal (oponent)
Eukaryotní geny obsahují nekódující sekvence - introny, které jsou z pre-mRNA odstraňovány sestřihovými komplexy. Sestřihové komplexy se skládají z pěti RNA-proteinových podjednotek (U1, U2, U4/U6 a U5), které postupně nasedají na pre-mRNA a jsou společně s dalšími bílkovinami nutné pro vystřižení intronu. Mutace v bílkovinách důležitých pro RNA sestřih mohou způsobovat vážná onemocněním, například mutace zvaná AD29 vedoucí k záměně jediné aminokyseliny v proteinu hPrp31 (tato bílkovina je součástí U4/U6 sestřihového komplexu) je příčinou nemoci retinitis pigmentosa, která často končí úplnou slepotou. Ukázali jsme, že hPrp31 AD29 mutant je nestabilní a není řádně začleněný do sestřihových komplexů. Přesto vadný hPrp31 zřejmě má vliv na metabolismus buňky, protože zpomaluje buněčný růst a dělení, což by mohlo vysvětlit, proč tato mutace vede k retinitis pigmentosa. Dále se zaměřujeme na roli buněčného jádra v pre-mRNA sestřihu. Nové U4/U6·U5 snRNP částice jsou přednostně skládány v nemembránových jaderných strukturách - Cajalových tělíscích. Zjistili jsme, že Cajalova tělíska jsou také důležitá pro recyklaci U4/U6·U5 snRNP. Vedle toho jsme se zaměřili na roli chromatinu (především acetylace histonů) při regulaci alternativního sestřihu. Pomocí inhibitorů histonových deacetylázy jsme změnili...
|
|
|
Analýza a charakterizace sestřihových variant BRCA1
Hojný, Jan ; Kleibl, Zdeněk (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent)
Breast cancer gene 1 (BRCA1) kóduje jaderný fosfoprotein, jehož základní funkce spočívá v regulaci odpovědi na poškození genomové DNA. Protein BRCA1 se podílí na vzniku a funkci proteinových superkomplexů, které se účastní reparace dvouřetězcových zlomů. Tyto superkomplexy vznikají na základě protein-proteinových interakcí mezi vysoce konzervativními doménami proteinu BRCA1 a jeho vazebnými partnery. Kromě divoké formy (wt) BRCA1 mRNA obsahující všech 22 exonů kódujících protein o velikosti 220 kD, byla popsána řada alternativních sestřihových variant (ASV) BRCA1 mRNA, které dávají vzniknout proteinovým izoformám postrádajícím významné strukturní domény. Předpokládá se, že vznik ASV BRCA1 mRNA je jednou z možností regulace funkce BRCA1 proteinu. Do současné doby není znám komplexní profil ASV BRCA1 ve fyziologických tkáních či míra a tkáňová specifičnost jejich exprese. Studium těchto aspektů bylo náplní této práce. Na vzorcích celkové RNA jsme optimalizovali postup identifikace ASV BRCA1 včetně celých transkriptů wt BRCA1 s délkou přes 5,5 kb. V následně vyšetřovaných vzorcích RNA izolované z periferní krve pacientek s karcinomem prsu a žen bez nádorového onemocnění jsme vedle wt formy identifikovali celkem 13 ASV BRCA1 mRNA. Většina (9/13) identifikovaných ASV BRCA1 reprezentovala formy se...
|
host ::
RSS.